Während ihrer zufälligen Bewegung erfahren Biomoleküle eine Vielzahl von Wechselwirkungen, die ihre Bahnen vorübergehend miteinander verbinden. Es ist äußerst schwierig, solche Bindungsereignisse im Kontext einer lebenden Zelle direkt zu messen: Wechselwirkungen können kurzlebig sein, sie können nur einen kleinen Teil der Moleküle betreffen, oder sie können nicht zu einem makroskopisch beobachtbaren Effekt führen. Wir haben eine Bildgebungsmethode für einzelne Moleküle entwickelt, mit der sich Assoziationen mobiler Moleküle nachweisen und quantifizieren lassen. Durch "Ausdünnen von Clustern unter Beibehaltung der Stöchiometrie der Markierung" (TOCCSL) können wir die Sonde praktisch direkt in der Zelle verdünnen, ohne die Fluoreszenzmarkierung einzelner Cluster zu beeinträchtigen.

Im Wesentlichen wird durch das Bleichen von fluoreszierenden Markern eine Analyseregion in der Zelle geschaffen, in der sich keine aktive Sonde mehr befindet. Brownsche Bewegung oder andere Transportprozesse führen dazu, dass aktive Sondenmoleküle wieder in die Analyseregion gelangen. Zu Beginn des Erholungsprozesses können einzelne Spots als gut getrennte, beugungsbegrenzte Signale aufgelöst werden. Die Standard-Einzelmolekülmikroskopie ermöglicht dann die Charakterisierung der Spots hinsichtlich ihrer Zusammensetzung und Mobilität.

Wissenschaftliche Abbildung Skizze der Wirkung auf fluoreszenzmarkierte künstliche Cluster

Die Idee hinter TOCCSL

Die obere Reihe zeigt Originaldaten, die untere Reihe eine Skizze der Wirkung auf fluoreszenzmarkierte, künstliche Cluster. (i) stellt die Situation dar, in der die Oberflächendichte zu hoch ist, um einzelne fluoreszenzmarkierte Antikörpermoleküle aufzulösen. Der Analysebereich wurde durch Abbildung einer runden Blende auf die Objektebene definiert. Unmittelbar nach dem Bleichen ist die Probe völlig frei von jedem Fluoreszenzsignal (ii). Zu Beginn der Fluoreszenz-Regenerierungsphase können aufgrund der Brownschen Bewegung einzelne fluoreszenzmarkierte Biomoleküle als gut voneinander getrennte Signale innerhalb des Analysebereichs beobachtet werden (iii). Nach einer längeren Regenerierungszeit erreicht das System wieder den Gleichgewichtszustand, ähnlich dem Bild vor dem Bleichen (iv).

Das Bild der einzelnen beugungsbegrenzten Signale wird durch die Punktabbildungsfunktion (PSF) des optischen Systems beschrieben. Die PSF kann gut durch ein zweidimensionales Gauß-Profil approximiert werden, das die Position (x,y), die Helligkeit B, den lokalen Hintergrund und die volle Breite bei halbem Maximum (FWHM) einzelner beugungsbegrenzter Signale liefert. Für die Stöchiometrie-Analyse wird die Verteilung der Helligkeitswerte ρ(B) herangezogen. Sie sollte eine lineare Kombination der Helligkeitsverteilungen der verschiedenen N-Mere sein: ρ(B)=∑N αN ρN(B), wobei αN die entsprechenden statistischen Gewichte sind. Die theoretische Intensitätsverteilung von N ko-lokalisierten unabhängigen Emittern, ρN(B), kann aus der gemessenen Helligkeitsverteilung der Monomere, ρ1(B), rekursiv als eine Reihe von Faltungsintegralen ρN(B) = ∫ρ1(B) ρN-1(B-B')dB' berechnet werden.

Die Abbildung zeigt die Stöchiometrie-Analyse eines typischen TOCCSL-Experiments

© TU Wien

Stöchiometrie-Analyse eines typischen TOCCSL-Experiments

bei dem wir die Stöchiometrie der Untereinheiten des Orai1-Ionenkanals untersuchten. Das linke Feld zeigt die Helligkeitsverteilungen der detektierten Signale im TOCCSL-Bild (grau) und nach zusätzlichem moderaten Bleichen zur Annäherung an die Einzelmolekül-Helligkeit (schwarz). Die Originaldaten sind als gepunktete Linien aufgetragen, die Ergebnisse der Kurvenanpassung als durchgezogene Linien. Wir zeigen hier die Anpassungsergebnisse unter der Annahme einer linearen Kombination von vier Gauß-Verteilungen. Die Gewichte der einzelnen Gaußschen Verteilungen, die mit Hilfe des TOCCSL-Bildes bestimmt wurden, sind im rechten Feld (schwarze Balken) dargestellt, wobei hauptsächlich vier ko-lokalisierte Protomere assoziiert sind. Die beobachteten 40 % Dimere und Trimere stellen höchstwahrscheinlich nicht fluoreszierendes mGFP dar; aus dem Binomial-Fit wurde ein mGFP-Reifungsgrad von 88 % geschätzt (graue Balken).

Unsere wichtigsten Publikationen

Monomeric TCRs drive T cell antigen recognition

Brameshuber, M., F. Kellner, B. K. Rossboth, H. Ta, K. Alge, E. Sevcsik, J. Göhring, M. Axmann, F. Baumgart, N. R. J. Gascoigne, S. J. Davis, H. Stockinger, G. J. Schütz, and J. B. Huppa. 2018. Monomeric TCRs drive T cell antigen recognition. Nature Immunology 19(5):487–496, öffnet eine externe URL in einem neuen Fenster

Wir verwendeten TOCCSL, um die Hypothese des oligomeren Zustands des T-Zell-Rezeptors (TCR) zu überprüften. Wir haben keine Hinweise auf das Vorhandensein von TCR-Dimeren oder höheren Strukturen gefunden.

Direct PIP2 binding mediates stable oligomer formation of the serotonin transporter

Anderluh, A., T. Hofmaier, E. Klotzsch, O. Kudlacek, T. Stockner, H. H. Sitte, and G. J. Schütz. 2017. Direct PIP2 binding mediates stable oligomer formation of the serotonin transporter. Nature Communications 8:14089, öffnet eine externe URL in einem neuen Fenster.

Wir fanden heraus, dass die SERT-Oligomerisierung vom PIP2-Gehalt abhängig ist.

Single molecule analysis reveals coexistence of stable serotonin transporter monomers and oligomers in the live cell plasma membrane

Anderluh, A., E. Klotzsch, A. W. Reismann, M. Brameshuber, O. Kudlacek, A. H. Newman, H. H. Sitte, and G. J. Schütz. 2014. Single molecule analysis reveals coexistence of stable serotonin transporter monomers and oligomers in the live cell plasma membrane. J Biol Chem 289(7):4387-4394, öffnet eine externe URL in einem neuen Fenster.

Wir haben die Stöchiometrie des Serotonin-Transporters (SERT) quantifiziert und dabei eine breite Verteilung bis hin zu Pentameren festgestellt.

Detection and quantification of biomolecular association in living cells using single-molecule microscopy

Brameshuber, M. and G. J. Schütz. 2012. Detection and quantification of biomolecular association in living cells using single-molecule microscopy. Methods in Enzymology 505: 159-186, öffnet eine externe URL in einem neuen Fenster.

Wir beschreiben detailliert den TOCCSL-Ansatz, geben mehrere Beispiele für die Verwendung von TOCCSL zur Bestimmung der Stöchiometrie von Membranproteinen und bieten einen kleinen "User Guide für TOCCSL".

Two-color single molecule tracking combined with photobleaching for the detection of rare molecular interactions in fluid biomembranes

Ruprecht, V., M. Brameshuber, and G. J. Schütz. 2010. Two-color single molecule tracking combined with photobleaching for the detection of rare molecular interactions in fluid biomembranes. Soft Matter 6(3):568-581, öffnet eine externe URL in einem neuen Fenster.

Wir haben das Zweifarben-TOCCSL als verbessertes Werkzeug für die Einzelmolekül-Ko-Lokalisierungsanalyse vorgestellt.

Imaging of Mobile Long-lived Nanoplatforms in the Live Cell Plasma Membrane

Brameshuber, M., J. Weghuber, V. Ruprecht, I. Gombos, I. Horvath, L. Vigh, P. Eckerstorfer, E. Kiss, H. Stockinger, and G. J. Schütz. 2010. Imaging of Mobile Long-lived Nanoplatforms in the Live Cell Plasma Membrane. J Biol Chem 285(53):41765-41771, öffnet eine externe URL in einem neuen Fenster.

In dieser Publikation gingen wir der Frage nach, ob der mutmaßliche Marker von Lipid Rafts, mGFP-GPI, eine cholesterinabhängige Assoziation zeigt. Wir fanden eine kleine, aber signifikante Fraktion von Dimeren.

Resting state orai1 diffuses as homotetramer in the plasma membrane of live Mammalian cells

Madl, J., J. Weghuber, R. Fritsch, I. Derler, M. Fahrner, I. Frischauf, B. Lackner, C. Romanin, and G. J. Schutz. 2010. Resting state orai1 diffuses as homotetramer in the plasma membrane of live Mammalian cells. J Biol Chem 285(52):41135-41142, öffnet eine externe URL in einem neuen Fenster.

Wir verwendeten TOCCSL, um die Stöchiometrie der Untereinheiten des Ionenkanals Orai1 zu untersuchen, die im Wesentlichen Tetramere bilden.

Thinning out clusters while conserving stoichiometry of labeling

Moertelmaier, M., M. Brameshuber, M. Linimeier, G. J. Schütz, and H. Stockinger. 2005. Thinning out clusters while conserving stoichiometry of labeling. Appl Phys Lett 87:263903, öffnet eine externe URL in einem neuen Fenster.

Proof of Principle Paper, in dem wir die TOCCSL-Methode zum ersten Mal vorgeschlagen haben.