Für biologische Untersuchungen braucht man oft ganz besondere Mikroskopie-Methoden. Sie sollen eine hervorragende Auflösung haben, vorzugsweise unterhalb  der Auflösungsgrenze von sichtbarem Licht, sie sollen Tiefeninformation liefern, und am besten soll das alles auch noch sehr schnell und in einem einzigen Schritt möglich sein, weil sich lebende  biologische Proben ständig in Bewegung befinden. Bisher schien das unmöglich – doch von der TU Wien und dem IMP Wien wurde nun eine neue Fluoreszenz-Mikroskopiemethode entwickelt, die all diese Vorteile vereint. Sie wurde im Fachjournal PNAS vorgestellt.

Leuchtende Moleküle, eingebaut in lebenden Zellen
Wenn es nicht genügt, eine Probe zu beleuchten, dann muss man sie eben selbst leuchten lassen. In der Fluoreszenzmikroskopie baut man in eine Probe ganz gezielt Moleküle ein, die Licht aussenden, wenn sie mit einem Laserstrahl von außen angeregt werden. So kann man etwa bestimmte Strukturen in einer Zelle markieren, oder man kann sichtbar machen, an welchem Ort sich bestimmte chemische Substanzen gerade befinden. Diese Art der Mikroskopie wird heute mit großem Erfolg betrieben.

Schwierig ist es allerdings, mit einer Genauigkeit im Nanometer-Bereich festzustellen, in welcher Höhe sich ein solches fluoreszierendes Molekül innerhalb einer Zelle befindet – und genau das ist für viele Bio-Anwendungen oft wichtig. Zwar gab es bisher schon verschiedene Ansätze, dieses Problem zu lösen, doch sie alle beruhten darauf, über einen längeren Zeitraum hinweg eine Reihe von Bildern der Probe zu erstellen und sie dann am Computer zu einem hochauflösenden Gesamtbild zusammenzusetzen. Bewegungen und rasche Veränderungen innerhalb der Probe kann man damit freilich nicht sichtbar machen.

Die Farbe verrät den Abstand
Die neue Methode ermöglicht nun, Abstandsinformation aus der Farbe (bzw. der spektralen Information) der einzelnen fluoreszierenden Moleküle zu gewinnen. Zunächst senden alle Moleküle Licht derselben Wellenlänge aus. Doch wenn diese Lichtemission in der Nähe einer metallischen Oberflächeauftritt, kommt es zu drastischen Veränderungen: „ Auf der Oberfläche wird durch das Licht ein plasmonischer Effekt angeregt“, erklärt Prof. Karl Unterrainer vom Institut für Photonik der TU Wien. Dieser Effekt ändert die Reflexionseigenschaften der Oberfläche, sodass Moleküle mit unterschiedlichem Abstand zur Oberfläche unterschiedliche Verschiebungen ihres Lichtspektrums erfahren.

„Man schließt also letztlich aus der ‚Farbe‘ eines Moleküls auf dessen Position“, erklärt Alexander Urich, der die Methode an der TU Wien mitentwickelte. Der Abstand des Moleküls zum Substrat lässt sich nun mit einer Genauigkeit von etwa zehn Nanometern bestimmen. Das entspricht etwa einem Fünfzigstel der Wellenlänge des verwendeten Lichts – die Technik ist also um ein vielfaches mächtiger als gewöhnliche Lichtmikroskopie.

Ein Substrat auf glatten, dünnen Schichten
„Das Substrat, auf dem die Probe platziert wird, besteht aus sehr glattem Quarzglas mit einer dünnen Schicht Silber, von etwa zehn bis fünfzehn Nanometern Dicke, und einer dünnen Schicht Siliziumnitrid, von fünf bis zehn Nanometern“, sagt Alexander Urich. „Die Herstellung dieser Substrate war eine ganz besondere Herausforderung, weil solche Silberfilme meist eine zu hohe Rauigkeit aufweisen. Für unsere Anwendung wurden allerdings extrem glatte Oberflächen benötigt.“

Der entscheidende Durchbruch gelang durch die Verwendung eines zusätzlichen Germaniumfilms von nur ein bis zwei Nanometern, der die Rauigkeit des Silberfilms reduziert und damit die hochauflösende Mikroskopie erst möglich macht.

Entwickelt, hergestellt und charakterisiert wurden die Substrate an der TU Wien, am IMP (Institut für Molekulare Pathologie) wurden anschließend biologische Studien durchgeführt – und das mit großem Erfolg. Man konnte das Protein Paxillin in lebenden Zellen untersuchen. Auch die Dynamik von Filopodien, kleinen Zellfortsätzen, die sich rasch verändern, konnte mit der neuen Methode sichtbar gemacht werden.

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